Dobrý den, já jsem John Melville ze společnosti Vernier Software and Technology.
Dnes vám představím náš malý spektrometr
Spectrovis Plus.
Je to jedno z mých nejoblíbenějších zařízení,
které tu ve Vernieru máme.
Na rozdíl od starších typů spektrometrů,
které mohou najednou měřit jedinou vlnovou délku,
toto zařízení měří celou škálu vlnových délek současně.
Všechno od fialové po červenou.
A dělá to všechno najednou,
takže jej můžete použít k zobrazení
celého absorpčního spektra nějaké sloučeniny,
ať už je to síran nikelnatý, chlorofyl nebo červené potravinářské barvivo.
Zařízení pracuje tak,
že uvnitř je malý světelný zdroj,
světlo putuje skrz kyvetu,
pak projde skrz difrakční mřížku
a po průchodu mřížkou
dopadne světlo, které se rozdělilo na barvy duhy,
na maličký detektor na zadní stěně přístroje.
A je to tenhle detektor, který dokáže zobrazit
všechny vlnové délky současně.
Ke kalibraci spektrometru použiji vzorek vody.
Je třeba nezapomínat, že pokud studuji absorbanci,
jde mi o bezrozměrnou veličinu.
Měříme vlastně množství světla, které projde skrz
nějaký roztok v porovnání s naším neutrální vzorkem
V tomto případě je neutrálním vzorkem voda.
Zkalibrujeme tedy zařízení.
Stačí se dotknout obrazovky.
Zvolím „Kalibrovat…“.
Počkám několik sekund na detekci.
Běžné spektrometry potřebují
10 až 15 minut k zahřátí.
Tomuto spektrometru k zahřátí stačí 90 sekund,
které se počítají od chvíle připojení k měřáku/počítači.
Já už jsem ale mluvil déle než 90 sekund,
takže, kdybych chtěl, mohl bych přeskočit žhavení.
Teď zařízení zkalibruji.
Důležité je, že uvnitř nechávám neutrální vzorek.
Pak klepnu na tlačítko OK.
A nyní se mohu podívat na vzorek.
Prozkoumejme tedy síran nikelnatý.
Tady síran nikelnatý máme.
Vložím ho dovnitř spektrometru,
a k tomu, abych viděl celé jeho absorpční spektrum,
stačí kliknout na tlačítko „Start“.
Máme pěkné absorpční spektrum.
Zde vidíte,
že máme velkou absorbanci mezi purpurovou a modrou
a velmi nízkou od modré po zelenou
a v červené oblasti pak naroste.
Graf je někdy poměrně těžko vidět,
takže vám ukážu malý trik,
jak minimalizovat duhové pozadí.
Já mám to pozadí v barvách duhy rád,
ale je tu pohodlná cesta,
jak ho na LabQuestu minimalizovat:
Dvojklikněte poblíž horní hrany grafu.
Takhle.
Teď vidíte pík absorbance v modrofialové,
nízkou absorbanci od modré po zelenou
a nárůst absorbance v červené.
Kdybych si chtěl měření uložit,
stačilo by klepnout na tlačítko „Uložit“ zde.
A pak bych mohl měřit, třebas… červené potravinářské barvivo.
Takové červené barvivo
by pravděpodobně mělo absorbovat nejvíc v zelené oblasti.
A tady to máme.
Když se podíváte na maximum absorbance barviva,
je vidět, že trochu absorbuje v této oblasti,
u modré, a narůstá, jak se dostáváme k zelené.
Napříč zelenou začíná klesat,
a v červené je absorbance velmi nízká.
To znamená, že všechny tyto vlnové délky
prochází skrz roztok volně.
A to je ten pravý důvod, proč je roztok červený.
A teď bych vám rád ukázal jinou aktivitu.
Toto je důvod, proč patří tenhle spektrometr
k mým nejoblíbenějším kouskům vybavení.
Měření, které provádí většina biologů,
se nazývá „Akční spektrum chlorofylu“.
Tahle laboratorní práce se měří na univerzitách i středních školách.
A místo toho, aby trvala 45 minut,
uvidíte, že zabere zhruba 2 minuty.
Vrátím se na obrazovku měřáku.
Zvolím „Soubor“ – „Nový“
Stará data mohu zahodit („Vyřadit“).
K tomu, jak jsem extrahoval chlorofyl:
Vzal jsem špenát a extrahoval
chlorofyl s použitím isopropylalkoholu.
Tohle je můj neutrální vzorek – isopropylalkohol.
Vložím ho do spektrometru.
Znovu zkalibruji.
Uvědomíme se, že zařízení už je zahřáté,
takže, jakmile se obrazovka objeví, mohu žhavení přeskočit.
Dokončím kalibraci „Dokončit kalibraci“.
Klepnu na OK.
Vezmu extrakt chlorofylu,
vložím do spektrometru,
klepnu na tlačítko „Start“.
A, voilà, máme to tu.
Pojďme se na měření podívat.
Opět dvojkliknu na obrazovku.
A zde vidíte, je to opravdu pěkně vidět,
tohle je, co učitelé obvykle chtějí, abyste viděli,
tedy že chlorofyl absorbuje hodně v modré oblasti,
a malinko v červené.
Jak už jsem řekl, jeden z důvodů, proč mám tohle zařízení tak rád, je,
že tohle měření zabere zhruba 2 minuty,
a pak už se můžete třeba věnovat
nějakým zajímavějším badatelsky orientovaným aktivitám.
Druhá opravdu zajímavá vlastnost tohoto zařízení je,
že může být současně použito i jako fluorimetr.
Co je fluorimetr: existují sloučeniny
jako třeba chlorofyl, které absorbují různé vlnové délky světla
a potom je re-emitují,
na pohled tak nějak světélkují.
Toto je velmi důležitý koncept
na poli biomedicíny.
A jde o jeden z důvodů, proč jsou rostliny
schopny absorbovat sluneční energii a doopravdy ji využít.
Velmi snadno vám teď ukážu, jak demonstrovat fluorescenci.
Vrátím se na obrazovku měřáku.
Stačí jenom změnit to, jak přístroj pracuje.
Klepnu na obrazovku,
a změním jednotky („Změnit jednotky“) na „Fluorescence“.
Ve spektrometru jsou vestavěny 2 LED diody,
které mohou být pro fluorescenci využity.
První je fialová LED s vlnovou délkou 405 nm,
druhá je modrozelená LED,
která má 500 nm.
LED s 405 nm je navržena přímo pro chlorofyl
a pro GFP (zelený fluorescenční protein).
Zvolím tedy „405 nm“.
Zahodím („Vyřadit“) minulá data.
A teď mi jde o toto –
kdybyste se mohli podívat dovnitř této malé kyvety,
viděli byste, že světélkuje červenou barvou.
Takže stisknu „Start“.
A je to.
Vidíme zde fluorescenční spektrum chlorofylu.
Obsahuje současně chlorofyl a i chlorofyl b.
Podívejte se, že emitují v červené oblasti, kde je v grafu pík.
Možná jste si všimli,
že když jsem spektrometr používal ve fluorescenčním režimu,
nekalibroval jsem ho.
Tak to je – když jej používáte v režimu fluorescence,
nemusíte ho kalibrovat.
To je velice příjemné, protože když si všimnete
výšky píku zde, je to zhruba 0,6.
Abychom se dívali na dobrý tvar, na dobrý fluorescenční pík,
bylo by lepší, kdyby byl o něco vyšší,
o něco blíž k jedné, 0,8 nebo 0,9 by bylo dobrých.
Co s tedy udělám – ukážu vám,
jak změnit dobu snímání, abych detektoru
umožnili snímat světlo déle
a pík byl větší.
Stejným způsobem lze pík i snížit,
pokud dojde k přetečení rozsahu detektoru.
Pokud jste ale v režimu absorbance,
dobu snímání nikdy neměňte.
V režimu absorbance je třeba kalibrace
a není třeba měnit dobu snímání.
V režimu fluorescence běžně dobu snímání měníme,
abychom zvýšili nebo snížili pík, který vidíme na obrazovce.
Chci-li dobu snímání změnit,
musím se vrátit na obrazovku měřáku
a klepnout sem, kde je napsáno „Režim“.
Vidíte zde parametry měření.
Jsou tu položky nazvané „Rychlost snímání“,
„Vyhlazování vlnových délek“, „Z kolika hodnot dělat průměr“.
Změním číslo, které je v kolonce „Rychlost snímání“.
Trošku ho zvýším.
Vložím sem „100“.
Vyhovuje mi přemýšlet o tom, jako o rychlosti závěrky
fotoaparátu z dob, kdy fotoaparáty závěrky doopravdy měly.
Dovolíte přístroji posbírat více světla
a pík se tak zvětší.
Když dobu snímání snížím, zkracuji dobu,
po kterou se detektor na vzorek dívá,
a pík se sníží.
Klepnu na OK.
Porovnejme teď ty dva píky.
Poslední měření si uložím.
Podívám se na následující pík.
A máme to.
Vidíme, že výška tohoto píku
je 0,758 (fluorescence).
Jsou to relativní jednotky, je to bezrozměrné.
Mohu se podívat na oba klepnutím sem,
pohledem na všechna měření „Všechna měření“.
Jsou tu dva píky.
Zvedl jsem výšku tohoto píku.
Doufám, že se vám líbilo toto malé předvedení
našeho spektrometru SpectroVis Plus,
který je jedním z mých nejoblíbenějších přístrojů,
které ve Vernieru máme.
Máte-li další otázky ohledně spektroskopie
nebo dalších čidel, navštivte naše webové stránky:
www.vernier.cz